液氮超低溫保存技術在果樹種質資源保存中的應
時間:2019-12-03 15:16來源: 作者:ydgmve2020yyx 點擊:
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目前，世界上的植物遺傳基礎趨向單一化，一些地方品種及珍貴稀有的作物資源也從地球上逐漸消失。因此世界各國對種質資源的收集和保存都非常重視，近幾十年來，液氮超低溫保存
目前，世界上的植物遺傳基礎趨向單一化，一些地方品種及珍貴稀有的作物資源也從地球上逐漸消失。因此世界各國對種質資源的收集和保存都非常重視，近幾十年來，液氮超低溫保存技術發展迅速，為種質資源的保存開辟了新的途徑。查特液氮罐
1 液氮超低溫保存技術原理及優點
通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫。超低溫冷凍保存一般以液態氮為冷源，使保存溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下，新陳代謝活動基本停止，處于"生機停頓"(Suspanded animation)狀態。這就有可能極大地延長儲存材料的壽命，而不產生遺傳變異，從而有效地、安全地長期保存那些珍貴稀有的種質。 利用液態氮保存植物種質，液氮冷凍容器就是液氮罐。除了1～2個月補充一次液氮外，不需要機械空調設備及其它管理，節省了大量的人力和物力。并且可以保持被保存組織及細胞培養物的遺傳穩定性。因此比其它保存方法有著很大的優點。
2 基本程序
2.1 材料的準備與選擇
超低溫保存的材料一般選擇處在指數增長的細胞材料。如愈傷組織的超低溫保存一般選擇培養18～24d的培養物作為材料。
2.2 預處理
使保存材料達到最適合于超低溫保存的生理狀態。主要是提高分裂相細胞的比例的減少細胞內自由水含量。
2.3 放入冰浴
將材料裝入試管或其他保存容器中，并隨既插入冰浴中。
2.4 加入保護劑
加入0℃預冷冰凍保護劑，在0℃冰浴中放團置30～45min。
2.5 降溫冰凍
(1)直接投入液氮。
(2)程序慢速0.05～5℃/min降溫到投入液氮。
(3)慢速降溫到預凍溫度(-30℃)，停留一段時間(1～3h)后投入液氮。
(4)逐級降溫后投入液氮，如：0℃——-10℃(5min)——-15℃(5min)——-23℃(5min)——-30℃(5min)——-40℃(5min)——-196℃(液氮)。
2.6 保存后的化凍
一般在37℃～40℃溫水中快速化凍。
2.7 活力鑒定
通常采用TTC法，也稱氯化三苯四液唑還原法。如果是單細胞或原生質體，可以采用活性熒光素染色法，顯示活細胞，統計存活率。
2.8 再培養
觀察組織細胞恢復生物的速度，存活率，植株的再生能力。
2.9 遺傳性狀分析
植株形態特征，生長發育，染色體、同工酶譜及抗逆性等。
3 影響超低溫保存效果的因素
3.1 材料的特性
包括植物的基因型，抗凍性，器官、組織和細胞怕年齡、生理狀態等。這些因素對眧低溫保存效果有很大的影響，從而要求在整個保存處理過程中采取相應的，符合其特性的各種適宜的措施。比如材料如果是含量有液胞小、含水量小的細胞(如莖尖分生組織等)，可用用快速降溫冰凍方法。含液胞大、含水量高的細胞的則一般需要采用慢速降溫法律等等。
3.2 預處理
是為了使保存材料達到超低溫保存所要求的生理特性：增加細胞分裂與分化的同步化。減少細胞慛自由水的含量。增強細胞的抗寒力。主要的方法有以下幾種。
3.2.1 細胞、組織繼代培養中，細胞分裂分化同步化調控。L.A.Withers等指出，有絲分裂前或稍后的細胞抗凍能力強，處于這個時期的細胞在超低溫保存后存活率高。
3.2.2 預培養：增加培養基中的糖濃度，提高滲透壓。或者在預處理培養基中加入誘導抗寒力的物質或冰凍保存劑，如脫落酸、山梨醇、二甲亞砜等。
3.2.3 低溫鍛煉：一些植物如康乃馨、蘋果等的莖尖在液氮保存前經過低溫鍛煉可以提高存活率。
另外，有些報道中采用上述幾種方法結合處理達到**效果。
3.3 冰凍保護劑
作為冰凍保存劑的物質需要具備發下特性：(1)易溶于水。(2)在適當的濃度下對細胞是無毒的。(3)化凍后容易從組織細胞中少清除。常用的冰凍保護劑有二甲基亞砜、甘油、糖的糖醇為物質等。
3.4 降溫冰凍方法
材料經冰凍保護劑在0℃預處理30～40min后，要立即降溫冰凍，最后到達液氮中保存，降溫方法是影響超低溫保存效果的關鍵因素之一，所以它在超低溫保存技術體系中一直是注意較多的一個方面。一般根據不肉中刺的保存對象有四種不同的降溫就去：快速冰凍法、慢速冰凍法、兩步冰凍法、逐級冰凍法。
3.5 化凍方法
大量的實驗證據表明，植物的凍害常常是發生在冰凍和化凍兩個過程中，因此除了需要有一個合適的降溫冰凍程序外，還要有一個合適的化凍方法，以避免在化凍過程中產生細胞內的次生結冰。并防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的在破壞。一般采用快速化凍法。即將液氮保存后的材料在37-40℃的溫水浴中化凍。因數超低溫冰凍材料化凍時，再次結冰的危險區域是-50℃～10℃.從理論上講可以借助迅速的化凍速度通過此溫度區，從而可以避免細胞內的次生結冰。但是如果材料是木本科和冬芽，那么在超低溫保存后必須在0℃低溫下進行慢速化凍才能達到良好效果，因為冬芽已經經過低溫鍛煉，細胞內的水分已經最在限度地流到細胞外結冰，快速化凍時會受到猛烈的滲透沖擊，從而會導致細胞膜的破壞，因此需要慢速解凍
4、在果樹質資源保存中的應用
4.1 花粉
最早在1922年，H.E.Knowlton就已經在金魚草花粉方面取得了一害的成功。他把金魚草花粉冷凍到-180℃后，仍然獲得了一定程度的花粉的超低溫成功保存已有許多報道。已經取得成功的有桃、李、木瓜、棗椰、鱷梨、胡桃等許多樹種。日本的Yatabe果樹試驗站利用超低溫保存技術已經保存了桃的60個栽培品種和品系的花粉，時間已達十年以上。
4.2 種子
種子在-18℃，含水量(5+1)%的情況下其新陳代謝仍然發生，導致生活力最終衰退。特別是執拗型種子的壽命更短，難以保存。超低溫保存技術可以克服這些不利因素，使種子保存更為長久。目前果樹方面利用超低溫保存種子有檸檬、海棠等。
4.3 枝條、芽及莖尖分生組織
由于莖尖分生組織細胞分化程度小，倍性一致辭，遺傳上比較穩定，且在離體條件下容易再生新植株，因此，莖尖的種質保存意義重大。枝條、芽也是保存無性繁殖植物種質的方便途徑。1978年日本學者就已報道了蘋果、梨、醋栗等果樹冬芽超低溫保存的成功。此后在蘋果、草莓等果樹莖尖保存中也取得了成功。
4.4 幼胚及胚狀體
單倍體細胞在遺傳上是不穩定的，超低溫保存將是保持單倍體穩定性的有效途徑。據Y.P.S.Bajiaj報道，柑桔的珠心胚經過液氮保存后存活率為24%～28%。
4.5 組織及細胞
愈傷組織及懸浮培養細胞的超低溫保存也是果樹種質資源保存的一個有途徑。在酸櫻桃、甘蔗、草莓等的愈傷組織及懸浮培養細胞的超低溫保存方面取得成功。
4.6 原生質體
原生質體具有多種用途，特別是在開辟果樹育種方面有著廣闊的前景，它是進行細胞雜交和基因工程的基礎材料。對原生質體的超低溫保存有著更大的優越性：與具有細胞壁的細胞相比，它降低了冰凍的危害，能得到更高的存活率。但是原生質體的超低溫保存要求較高，果樹原生質體的超低溫保存報道較少。馬峰旺等(1998)報道，杏的一些品種的懸浮培養物分離的原生質體超低溫保存后成活率可達40%。
超低溫保存技術在種質資源保存方面已經取得了很大的成就，相信隨著超低溫技術的發展，在這一方面的應用會愈加成熟，這一技術也必將為保持地球生態多樣性作出更大的項獻。查特液氮罐
1 液氮超低溫保存技術原理及優點
通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫。超低溫冷凍保存一般以液態氮為冷源，使保存溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下，新陳代謝活動基本停止，處于"生機停頓"(Suspanded animation)狀態。這就有可能極大地延長儲存材料的壽命，而不產生遺傳變異，從而有效地、安全地長期保存那些珍貴稀有的種質。 利用液態氮保存植物種質，液氮冷凍容器就是液氮罐。除了1～2個月補充一次液氮外，不需要機械空調設備及其它管理，節省了大量的人力和物力。并且可以保持被保存組織及細胞培養物的遺傳穩定性。因此比其它保存方法有著很大的優點。
2 基本程序
2.1 材料的準備與選擇
超低溫保存的材料一般選擇處在指數增長的細胞材料。如愈傷組織的超低溫保存一般選擇培養18～24d的培養物作為材料。
2.2 預處理
使保存材料達到最適合于超低溫保存的生理狀態。主要是提高分裂相細胞的比例的減少細胞內自由水含量。
2.3 放入冰浴
將材料裝入試管或其他保存容器中，并隨既插入冰浴中。
2.4 加入保護劑
加入0℃預冷冰凍保護劑，在0℃冰浴中放團置30～45min。
2.5 降溫冰凍
(1)直接投入液氮。
(2)程序慢速0.05～5℃/min降溫到投入液氮。
(3)慢速降溫到預凍溫度(-30℃)，停留一段時間(1～3h)后投入液氮。
(4)逐級降溫后投入液氮，如：0℃——-10℃(5min)——-15℃(5min)——-23℃(5min)——-30℃(5min)——-40℃(5min)——-196℃(液氮)。
2.6 保存后的化凍
一般在37℃～40℃溫水中快速化凍。
2.7 活力鑒定
通常采用TTC法，也稱氯化三苯四液唑還原法。如果是單細胞或原生質體，可以采用活性熒光素染色法，顯示活細胞，統計存活率。
2.8 再培養
觀察組織細胞恢復生物的速度，存活率，植株的再生能力。
2.9 遺傳性狀分析
植株形態特征，生長發育，染色體、同工酶譜及抗逆性等。
3 影響超低溫保存效果的因素
3.1 材料的特性
包括植物的基因型，抗凍性，器官、組織和細胞怕年齡、生理狀態等。這些因素對眧低溫保存效果有很大的影響，從而要求在整個保存處理過程中采取相應的，符合其特性的各種適宜的措施。比如材料如果是含量有液胞小、含水量小的細胞(如莖尖分生組織等)，可用用快速降溫冰凍方法。含液胞大、含水量高的細胞的則一般需要采用慢速降溫法律等等。
3.2 預處理
是為了使保存材料達到超低溫保存所要求的生理特性：增加細胞分裂與分化的同步化。減少細胞慛自由水的含量。增強細胞的抗寒力。主要的方法有以下幾種。
3.2.1 細胞、組織繼代培養中，細胞分裂分化同步化調控。L.A.Withers等指出，有絲分裂前或稍后的細胞抗凍能力強，處于這個時期的細胞在超低溫保存后存活率高。
3.2.2 預培養：增加培養基中的糖濃度，提高滲透壓。或者在預處理培養基中加入誘導抗寒力的物質或冰凍保存劑，如脫落酸、山梨醇、二甲亞砜等。
3.2.3 低溫鍛煉：一些植物如康乃馨、蘋果等的莖尖在液氮保存前經過低溫鍛煉可以提高存活率。
另外，有些報道中采用上述幾種方法結合處理達到**效果。
3.3 冰凍保護劑
作為冰凍保存劑的物質需要具備發下特性：(1)易溶于水。(2)在適當的濃度下對細胞是無毒的。(3)化凍后容易從組織細胞中少清除。常用的冰凍保護劑有二甲基亞砜、甘油、糖的糖醇為物質等。
3.4 降溫冰凍方法
材料經冰凍保護劑在0℃預處理30～40min后，要立即降溫冰凍，最后到達液氮中保存，降溫方法是影響超低溫保存效果的關鍵因素之一，所以它在超低溫保存技術體系中一直是注意較多的一個方面。一般根據不肉中刺的保存對象有四種不同的降溫就去：快速冰凍法、慢速冰凍法、兩步冰凍法、逐級冰凍法。
3.5 化凍方法
大量的實驗證據表明，植物的凍害常常是發生在冰凍和化凍兩個過程中，因此除了需要有一個合適的降溫冰凍程序外，還要有一個合適的化凍方法，以避免在化凍過程中產生細胞內的次生結冰。并防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的在破壞。一般采用快速化凍法。即將液氮保存后的材料在37-40℃的溫水浴中化凍。因數超低溫冰凍材料化凍時，再次結冰的危險區域是-50℃～10℃.從理論上講可以借助迅速的化凍速度通過此溫度區，從而可以避免細胞內的次生結冰。但是如果材料是木本科和冬芽，那么在超低溫保存后必須在0℃低溫下進行慢速化凍才能達到良好效果，因為冬芽已經經過低溫鍛煉，細胞內的水分已經最在限度地流到細胞外結冰，快速化凍時會受到猛烈的滲透沖擊，從而會導致細胞膜的破壞，因此需要慢速解凍
4、在果樹質資源保存中的應用
4.1 花粉
最早在1922年，H.E.Knowlton就已經在金魚草花粉方面取得了一害的成功。他把金魚草花粉冷凍到-180℃后，仍然獲得了一定程度的花粉的超低溫成功保存已有許多報道。已經取得成功的有桃、李、木瓜、棗椰、鱷梨、胡桃等許多樹種。日本的Yatabe果樹試驗站利用超低溫保存技術已經保存了桃的60個栽培品種和品系的花粉，時間已達十年以上。
4.2 種子
種子在-18℃，含水量(5+1)%的情況下其新陳代謝仍然發生，導致生活力最終衰退。特別是執拗型種子的壽命更短，難以保存。超低溫保存技術可以克服這些不利因素，使種子保存更為長久。目前果樹方面利用超低溫保存種子有檸檬、海棠等。
4.3 枝條、芽及莖尖分生組織
由于莖尖分生組織細胞分化程度小，倍性一致辭，遺傳上比較穩定，且在離體條件下容易再生新植株，因此，莖尖的種質保存意義重大。枝條、芽也是保存無性繁殖植物種質的方便途徑。1978年日本學者就已報道了蘋果、梨、醋栗等果樹冬芽超低溫保存的成功。此后在蘋果、草莓等果樹莖尖保存中也取得了成功。
4.4 幼胚及胚狀體
單倍體細胞在遺傳上是不穩定的，超低溫保存將是保持單倍體穩定性的有效途徑。據Y.P.S.Bajiaj報道，柑桔的珠心胚經過液氮保存后存活率為24%～28%。
4.5 組織及細胞
愈傷組織及懸浮培養細胞的超低溫保存也是果樹種質資源保存的一個有途徑。在酸櫻桃、甘蔗、草莓等的愈傷組織及懸浮培養細胞的超低溫保存方面取得成功。
4.6 原生質體
原生質體具有多種用途，特別是在開辟果樹育種方面有著廣闊的前景，它是進行細胞雜交和基因工程的基礎材料。對原生質體的超低溫保存有著更大的優越性：與具有細胞壁的細胞相比，它降低了冰凍的危害，能得到更高的存活率。但是原生質體的超低溫保存要求較高，果樹原生質體的超低溫保存報道較少。馬峰旺等(1998)報道，杏的一些品種的懸浮培養物分離的原生質體超低溫保存后成活率可達40%。
超低溫保存技術在種質資源保存方面已經取得了很大的成就，相信隨著超低溫技術的發展，在這一方面的應用會愈加成熟，這一技術也必將為保持地球生態多樣性作出更大的項獻。查特液氮罐
